Vacuna chilena contra DVB: el prototipo se diseñó por los subgenotipos locales, pero se validó contra el que ya cubría la vacuna comercial

Detalles adicionales del estudio

Campo	Detalle
Título original	Recombinant Subunit Vaccine Candidate against the Bovine Viral Diarrhea Virus
Autores	Avello V, Salazar S, González EE, Campos P, Manríque V, Mathieu C, Hugues F, Cabezas I, Gädicke P, Parra NC, Acosta J, Sánchez O, González A, Montesino R
Instituciones	Laboratorio de Biotecnología y Biofármacos, Departamento de Fisiopatología, y Departamento de Farmacología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. Departamento de Patología y Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Concepción, Chillán. Sección Virología de la Red de Laboratorios de Salud Animal del SAG, Lo Aguirre. Universidad de Medellín, Colombia. University of Miami
Diseño del catastro	Muestreo en predios infectados desde la Región del Maule hasta Magallanes, entre enero de 2019 y diciembre de 2022, más muestras de la seroteca del SAG en Osorno
Antígeno vacunal	Ectodominio de la glicoproteína E2 de cinco subgenotipos (1a, 1b, 1c, 1d, 1e), expresado en células CHO-K1, purificado por cromatografía de afinidad por metal inmovilizado, formulado en adyuvante Montanide ISA 61 VG
Comparador	Vacuna comercial CattleMaster Gold FP 5 (Zoetis), que contiene subgenotipo 1a y genotipo 2
Esquema	Dos dosis intramusculares, días 0 y 21. En ovinos se evaluaron 50, 100 y 150 µg; en bovinos se usó 50 µg
Ensayo de neutralización	Cepa citopática Singer (BVDV-1a) a 100 TCID50, según protocolo del Manual de la OIE 2016. Neutralización considerada en diluciones iguales o superiores a 1:40
Aprobación ética	Comité de Ética de la Universidad de Concepción, protocolo CEBB-1054-2021
Financiamiento	FONDEF, Gobierno de Chile, proyecto ID21I10020
Conflictos de interés	Los autores declaran no tener conflictos de interés
Acceso	Acceso abierto bajo licencia Creative Commons. Se dispuso del texto completo, incluidas secciones de resultados, discusión y métodos

Por qué la diarrea viral bovina no se controla como otras virosis

La diarrea viral bovina genera pérdidas económicas estimadas en más de 70 millones de dólares en predios lecheros y de carne a nivel mundial, y la vacunación se usa para controlarla desde hace más de cinco décadas. Pese a esa antigüedad, el artículo identifica dos desafíos que siguen sin resolverse y que explican por qué el resultado dista de ser el esperado: la alta variabilidad genética y antigénica de los subgenotipos virales, y la infección fetal en vacas gestantes.

El segundo desafío es el que define la epidemiología de la enfermedad. Cuando la infección fetal ocurre durante los primeros tres meses de gestación, con el sistema inmune bovino todavía inmaduro, la cría nace persistentemente infectada. Estos animales no logran discriminar los antígenos virales de los propios, lo que resulta en una infección persistente que puede diseminarse a animales susceptibles a través de heces, descarga nasal, lágrimas y otras secreciones. Los animales persistentemente infectados son considerados la principal fuente de diseminación del virus.

El problema práctico que se deriva es de orden diagnóstico. Un animal persistentemente infectado no genera anticuerpos contra el virus que porta, de modo que las pruebas serológicas convencionales, que buscan anticuerpos, no lo identifican como infectado. Los datos del propio catastro chileno ilustran la magnitud del asunto: de 1.955 muestras de suero analizadas por ELISA para anticuerpos, 1.636 resultaron positivas, 302 negativas y 17 ambiguas. Al buscar antígeno viral en las 302 muestras negativas a anticuerpos, se identificaron 132 positivas, es decir, un 43,7% de las muestras seronegativas correspondió a animales con virus circulante. La condición de seronegativo, lejos de indicar animal sano, resultó ser en casi la mitad de los casos el marcador de un diseminador activo.

Un problema adicional que el propio catastro tuvo que sortear

Hay un detalle metodológico en el estudio que merece atención porque explica una limitación estructural de las vacunas convencionales. Los investigadores señalan que la presencia de anticuerpos podía deberse tanto a infección como a vacunación, lo que dificultó distinguir animales infectados de vacunados para genotipificar y determinar la incidencia viral real, y atribuyen esa dificultad a que en los predios se había utilizado la vacuna comercial CattleMaster Gold FP 5.

La consecuencia operativa fue que el equipo tuvo que descartar las 1.636 muestras seropositivas para el análisis de detección viral y trabajar solo sobre las seronegativas. En otras palabras, la vacunación previa inutilizó para efectos de vigilancia epidemiológica al 84% de las muestras recolectadas.

Este punto conecta con una limitación que el artículo enuncia respecto de las vacunas convencionales, tanto vivas modificadas como inactivadas: cuando se usan, resulta complicado diferenciar animales infectados de vacunados. Corresponde precisar algo que no aparece en el estudio y que no debe darse por supuesto: el artículo no evalúa ni afirma que su propio candidato resuelva esa limitación. No se realizaron ensayos de diferenciación entre animales infectados y vacunados con el prototipo. Que una vacuna de subunidad basada en un solo antígeno viral ofrezca en principio mejores condiciones para desarrollar una prueba diferencial que una vacuna de virus completo es una consideración razonable desde el diseño, pero permanece como una posibilidad no evaluada en esta publicación y no como un hallazgo demostrado.

Qué contiene el prototipo y qué se midió

El candidato se construyó con el ectodominio de la glicoproteína E2, que el artículo describe como el principal antígeno inmunogénico del virus y el que induce anticuerpos neutralizantes tras la infección natural. Las secuencias de cinco subgenotipos se clonaron y expresaron en células CHO-K1, se purificaron y se formularon en cantidades equivalentes con adyuvante oleoso.

En el ensayo en ovinos, con dosis de 50, 100 y 150 µg, los niveles de anticuerpos se hicieron evidentes al día 14 tras la primera inmunización, aumentaron al día 21 y tras el refuerzo del día 28, y se mantuvieron relativamente estables hasta el día 42. No hubo diferencias significativas entre las tres dosis, salvo en los días 28 y 35, donde la dosis de 150 µg superó significativamente a la de 100 µg. Sobre esa base se seleccionó la dosis menor, 50 µg, para continuar en la especie objetivo.

En bovinos se compararon tres grupos de ocho animales cada uno: control negativo, vacuna comercial y candidato a 50 µg. Los valores de densidad óptica fueron significativamente mayores en los días 14 y 21 solo en el grupo del candidato. Tras el refuerzo, ambos grupos vacunados mostraron incremento sostenido hasta el día 35, y desde el día 42 hasta el final del experimento hubo un descenso leve, siempre sobre valores de 0,6. Entre el grupo comercial y el candidato no hubo diferencias significativas en ningún tiempo evaluado tras el refuerzo, aunque el candidato mostró densidades ópticas más altas en todos los tiempos. La titulación de anticuerpos al día 56 tampoco arrojó diferencias significativas entre ambos.

En respuesta celular, los transcritos de IFN-γ resultaron casi indetectables al día 21 en ambos grupos vacunados, pero al día 42 aumentaron significativamente en el grupo del candidato, y al día 56 lo hicieron en ambos. Los transcritos de IL-12 mostraron incremento significativo únicamente en el grupo del candidato, en todos los tiempos evaluados. Los transcritos de IL-4, citoquina asociada a respuesta Th2, no se detectaron. El patrón es compatible con una respuesta celular de tipo Th1.

En seguridad, los ensayos no registraron variaciones de apetito ni consumo de agua en ovinos, ni enrojecimiento, hinchazón o dolor en el sitio de inyección, y las temperaturas rectales se mantuvieron dentro de rangos esperados para la especie en la mayor parte del experimento. Conviene señalar que se trata de observaciones en grupos pequeños y en ventanas de días, no de un estudio de seguridad de largo plazo.

La asimetría central: qué subgenotipo se validó y cuál circula

El catastro que fundamenta el diseño del prototipo abarcó predios infectados desde el Maule hasta Magallanes entre enero de 2019 y diciembre de 2022, complementado con muestras de la seroteca del SAG en Osorno. La secuenciación de 31 muestras positivas mostró que cerca del 80% correspondió a BVDV1b y el 20% restante a BVDV1d.

El equipo decidió incorporar cinco subgenotipos al candidato considerando también antecedentes previos: un tamizaje realizado en animales de la Región de Aysén en 2017 había reportado BVDV1b (25%), BVDV1d (8,3%) y BVDV1e (66,7%), constituyendo el primer reporte en Chile de los subgenotipos 1d y 1e, mientras que 1a, 1b y 1c habían sido reportados en Chile entre 1993 y 2001.

Aquí aparece el punto que define la lectura del estudio. El ensayo de neutralización se realizó utilizando el subtipo viral BVDV1a, mediante la cepa citopática Singer. La justificación que dan los autores es explícita y metodológicamente consistente: se eligió ese subgenotipo porque fue el que mostró la respuesta de anticuerpos más alta, significativamente distinta de la mayoría de los otros subgenotipos al evaluar la contribución individual de cada uno.

El resultado de esa evaluación individual, sin embargo, contiene el dato incómodo. Todas las proteínas E2 incluidas indujeron respuesta humoral, pero la más alta se detectó contra BVDV1a, significativamente distinta de las obtenidas contra BVDV1b, BVDV1c y BVDV1d. La contribución más baja a la respuesta inmune correspondió al subtipo BVDV1d.

Ordenando las dos observaciones: la neutralización se demostró contra BVDV1a, el subgenotipo que la vacuna comercial de comparación ya contiene; los subgenotipos que el catastro encontró circulando en Chile fueron 1b y 1d; y 1d fue el que menos respuesta humoral generó dentro del propio candidato. La brecha que justifica el desarrollo del prototipo, la ausencia de subgenotipos chilenos en las vacunas comerciales, es la brecha sobre la cual el estudio no aporta datos de neutralización.

Conviene ser preciso en la atribución de esta observación. Los propios autores la declaran en sus conclusiones al señalar que debe realizarse una caracterización adicional para corroborar la inducción de anticuerpos neutralizantes contra los otros cuatro subgenotipos del candidato recombinante. No se trata de una omisión advertida desde fuera sino de una limitación reconocida en el texto. Lo que corresponde agregar, y esto sí es una lectura propia y no una afirmación del artículo, es que esa limitación recae exactamente sobre el supuesto que da sentido al proyecto, de modo que su resolución no es un detalle pendiente sino la prueba central que falta.

Lo que el estudio no midió

Un ensayo de inmunogenicidad y un ensayo de eficacia protectora son cosas distintas, y este es lo primero y no lo segundo. No hubo desafío experimental con virus vivo tras la vacunación, de modo que no se demostró protección clínica. Tampoco se evaluó protección fetal, que es el objetivo sanitario decisivo, porque de la infección fetal dependen los animales persistentemente infectados que sostienen la circulación viral. El artículo menciona que las vacunas convencionales han demostrado protección fetal, y que en un estudio con vacuna inactivada los animales persistentemente infectados se eliminaron cuando la cepa circulante y la vacunal pertenecían al mismo subgenotipo, mientras que cuando el subgenotipo de campo difería del de la vacuna la protección contra descendencia persistentemente infectada no fue exitosa. Ese antecedente refuerza la importancia de la correspondencia entre cepa vacunal y cepa circulante, que es justamente lo que queda por verificar en este candidato.

Existe además una diferencia de composición que el artículo no discute en detalle. El candidato incluye cinco subgenotipos, todos pertenecientes al genotipo BVDV1. La vacuna comercial usada como comparador contiene subgenotipo 1a y genotipo 2. Es decir, el prototipo no incorpora antígenos de BVDV2. Si BVDV2 circula o llegara a circular en Chile es una pregunta que este estudio no aborda, y su respuesta condicionaría el alcance del candidato.

Sobre la interpretación de los títulos neutralizantes, el artículo introduce una cautela que conviene conservar. Ambas vacunas superaron valores de 1/256 frente a BVDV1a, sin diferencias significativas entre sí. Pero los autores advierten que en la literatura hay resultados contradictorios al intentar correlacionar los signos de protección animal con los valores de anticuerpos neutralizantes: un estudio estableció que los títulos no predijeron el nivel de protección en novillos inmunizados, mientras otras investigaciones han mostrado niveles apreciables de protección con títulos sobre 1/512, y títulos de 1/256 o superiores podrían contrarrestar los signos clínicos. Añaden que el concepto de protección parece estar también asociado a la inmunidad celular, dado que animales con bajos niveles de anticuerpos resultaron protegidos tras un desafío viral. Un título neutralizante alto es un indicio favorable, no una demostración de protección.

Finalmente, los grupos experimentales fueron de ocho bovinos, lo que impone límites a la potencia estadística para detectar diferencias moderadas entre el candidato y el comparador comercial.

Lo que hicieron los países que sí erradicaron la enfermedad

La revisión de los programas europeos permite situar el rol de la vacuna dentro del conjunto de herramientas de control, y el resultado es contraintuitivo respecto de lo que suele suponerse.

Los países escandinavos, Austria y Suiza implementaron con éxito sus programas de control sin utilizar vacunación. La vacunación se empleó como herramienta opcional y adicional en países como Alemania, Bélgica, Irlanda y Escocia. Los denominadores comunes de todos los programas exitosos fueron el control sistemático, la eliminación de animales persistentemente infectados, el control de movimiento para rebaños infectados, la bioseguridad estricta y la vigilancia. La vacuna no figura entre esos denominadores comunes.

El caso suizo ofrece cifras que dimensionan el enfoque. Con una seroprevalencia del 87%, la enfermedad era endémica en Suiza cuando el país lanzó un esfuerzo de control masivo testeando la población nacional de bovinos en 2008. En los cuatro años siguientes se testeó a todos los terneros recién nacidos, y la prevalencia de animales persistentemente infectados se redujo de 1,3% a 0,02%. Recién después de cinco años de detección viral se introdujo la vigilancia serológica mediante leche de estanque o suero.

El caso escocés muestra el orden de las operaciones cuando sí se vacuna. El esquema escocés adapta el enfoque combinado de eliminar animales persistentemente infectados y luego vacunar el rebaño una vez limpio, para evitar la reinfección. Para 2019, el 90% de los rebaños estaba libre de la enfermedad. La vacuna aparece en el segundo tiempo, para proteger lo ya saneado, no en el primero para sanear.

Las cifras económicas asociadas ayudan a entender por qué esos países asumieron el costo. Tras el programa de erradicación noruego entre 1992 y 2002, se estimó que los predios lecheros y de carne pudieron haber ganado hasta 29 millones de coronas noruegas. En el Reino Unido, las pérdidas anuales por la enfermedad se estimaron entre 5 y 31 millones de libras, con un costo de 37 libras por vaca al año en rebaños escoceses de cría.

Corresponde declarar el límite de esta comparación antes de trasladarla a Chile. Los países citados tienen sistemas de identificación individual obligatoria de bovinos, trazabilidad de movimientos y capacidad de fiscalización que hicieron viable el testeo universal de terneros. La estructura productiva chilena, con alta heterogeneidad entre grandes lecherías del sur y explotaciones pequeñas, y con una distribución geográfica extensa, plantea condiciones distintas cuya factibilidad este análisis no evalúa.

El estado del diagnóstico en Chile

La información disponible sobre presencia del virus en el país es abundante en serología y escasa en cuantificación de animales persistentemente infectados a escala nacional. Los estudios chilenos publicados muestran distribución amplia: en predios lecheros de la Región Metropolitana, 60% de las muestras individuales resultaron positivas a anticuerpos neutralizantes y la prevalencia predial alcanzó 96%. Un estudio en la misma región detectó una prevalencia animal de portadores inmunotolerantes de 18% y predial de 65%, valor que los propios autores calificaron de posiblemente subestimado porque 38 de 97 animales virémicos en un primer muestreo no pudieron ser diagnosticados en un segundo.

Estos antecedentes tienen dos o más décadas de antigüedad, lo que limita su valor para describir la situación actual, y su metodología no es directamente comparable con la del catastro reciente. Lo que sí permiten sostener es que la circulación viral está documentada en Chile desde hace tiempo y que la detección de animales persistentemente infectados ha sido históricamente difícil.

Un antecedente metodológico chileno merece mención por su vigencia conceptual. Un trabajo en 44 predios lecheros de la Región de Los Lagos exploró el muestreo predial pequeño, tomando sangre de diez animales de entre seis y doce meses, para predecir infección activa. La lógica se apoya en que los rebaños fuertemente infectados, donde la mayoría de los animales muestreados posee anticuerpos, probablemente contienen animales persistentemente infectados, mientras que en los débilmente infectados probablemente no. El propio estudio advierte que cuando los animales persistentemente infectados son muy jóvenes no son detectados por este método, porque toma algunos meses que infecten al resto del rebaño. Es una herramienta de tamizaje de bajo costo, no un sustituto de la identificación individual.

Interpretación Evidencia Vet

El estudio demuestra lo que se propuso demostrar en su diseño: que un candidato de subunidad con cinco proteínas E2 producidas en células de mamífero genera respuesta humoral y celular comparable a la de una vacuna comercial establecida, con un perfil Th1 y sin eventos adversos registrados en las ventanas evaluadas. Eso es un resultado sólido y no menor para un desarrollo nacional financiado con fondos públicos.

La distancia entre ese resultado y la conclusión que suele circular en la difusión del proyecto conviene marcarla con precisión. La afirmación de que el prototipo es más adecuado que las vacunas comerciales por contener los subgenotipos chilenos es, a la luz de este artículo, una hipótesis de diseño y no un hallazgo verificado. La única neutralización medida fue contra BVDV1a, que es el subgenotipo que la vacuna comercial comparadora ya contiene, y frente al cual ambas se comportaron sin diferencias significativas. Los subgenotipos que el catastro del propio equipo encontró circulando, 1b y 1d, no fueron evaluados en neutralización, y 1d fue además el de menor respuesta humoral individual. Los autores lo reconocen en sus conclusiones al indicar que falta caracterización adicional sobre los otros cuatro subgenotipos.

Corresponde corregir además una atribución que aparece en la comunicación pública del proyecto y que este artículo no respalda: la capacidad de diferenciar anticuerpos vacunales de los de infección de campo no fue evaluada en este estudio. El artículo describe esa dificultad como un problema de las vacunas convencionales, y de hecho los investigadores la sufrieron en su propio catastro, donde la vacunación previa con producto comercial obligó a descartar el 84% de las muestras para el análisis de detección viral. Que una vacuna de subunidad ofrezca en principio mejores condiciones para desarrollar una prueba diferencial es razonable como expectativa de diseño, pero no está demostrado aquí, y esa distinción importa porque la capacidad diferencial es justamente lo que haría auditable un futuro programa de control.

Sobre el conjunto del problema, la evidencia europea sugiere que la discusión sobre cuál vacuna usar está situada en un lugar secundario respecto del cuello de botella real. Escandinavia, Austria y Suiza erradicaron sin vacunar. Escocia e Irlanda vacunaron, pero después de remover a los animales persistentemente infectados y para proteger rebaños ya saneados. El denominador común de los programas exitosos fue el testeo sistemático y la eliminación de portadores, sostenidos por identificación individual y control de movimiento. Chile no tiene ese programa. Mientras no exista, el escenario más probable, y esto es una inferencia propia y no una proyección del estudio, es que una vacuna nacional mejor ajustada a los subgenotipos locales reduzca signos clínicos y pérdidas productivas en los predios que la adopten, sin modificar la circulación viral a escala nacional, porque los animales persistentemente infectados seguirán naciendo, sin ser detectados por serología, y seguirán diseminando.

El límite de esta síntesis: no se identificó una estimación nacional actualizada y metodológicamente comparable de la prevalencia de animales persistentemente infectados en Chile. El dato del 43,7% de muestras seronegativas con antígeno positivo proviene de predios seleccionados por estar infectados, de modo que no es extrapolable a la población bovina nacional. Sin una línea base confiable no es posible dimensionar el costo ni el beneficio de un programa de control, ni evaluar después si funcionó.

Conclusión

El prototipo desarrollado en la Universidad de Concepción constituye un avance técnico real: una vacuna de subunidad producida en células de mamífero, con cinco antígenos E2 correspondientes a subgenotipos descritos en Chile, que iguala en respuesta humoral y celular a un producto comercial establecido y que muestra un perfil de seguridad favorable en las condiciones evaluadas. Su prueba decisiva, sin embargo, está pendiente, y es precisamente la que corresponde al motivo de su desarrollo: demostrar neutralización frente a los subgenotipos que efectivamente circulan en el país, empezando por BVDV1b y BVDV1d, y demostrar después protección fetal, que es la que interrumpe la generación de animales persistentemente infectados. Mientras esa evidencia no exista, la ventaja sobre las vacunas comerciales sigue siendo una expectativa de diseño bien fundada y no un resultado establecido. Y aun cuando esa evidencia llegue, la experiencia de los países que erradicaron la enfermedad indica que la vacuna cumple un papel de segundo tiempo. El primero, que Chile todavía no ha dado, consiste en identificar y eliminar sistemáticamente a los portadores que la serología no detecta.

Puntos clave

• Los animales persistentemente infectados no generan anticuerpos contra el virus que portan, de modo que la serología convencional no los identifica y son la principal fuente de diseminación viral.
• En el catastro chileno, 132 de 302 muestras seronegativas resultaron positivas a antígeno viral, un 43,7%, en predios seleccionados por estar infectados.
• La vacunación previa con producto comercial obligó a descartar el 84% de las muestras del catastro para análisis de detección viral, porque no permitía distinguir infección de vacunación.
• La secuenciación de 31 muestras del catastro mostró cerca de 80% BVDV1b y 20% BVDV1d como subgenotipos circulantes.
• El ensayo de neutralización se realizó únicamente contra BVDV1a, subgenotipo que la vacuna comercial comparadora ya contiene, y ambas vacunas superaron títulos de 1/256 sin diferencias significativas entre sí.
• Al medir la contribución individual de cada antígeno, BVDV1d fue el que generó la respuesta humoral más baja del candidato.
• Los autores declaran en sus conclusiones que falta caracterización adicional para corroborar neutralización contra los otros cuatro subgenotipos.
• El estudio no evaluó protección clínica mediante desafío viral, no evaluó protección fetal y no evaluó capacidad de diferenciar animales infectados de vacunados.
• Escandinavia, Austria y Suiza erradicaron la enfermedad sin vacunación; el denominador común de todos los programas exitosos fue el testeo sistemático y la eliminación de animales persistentemente infectados.
• Suiza redujo la prevalencia de animales persistentemente infectados de 1,3% a 0,02% en cuatro años testeando a todos los terneros recién nacidos; Escocia alcanzó 90% de rebaños libres en 2019 removiendo portadores y vacunando después.

Referencias

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¿Qué significa esto en terreno?

• No interpretar un resultado seronegativo como equivalente a animal sano en rebaños con circulación viral, dado que en el catastro chileno un 43,7% de las muestras negativas a anticuerpos resultó positiva a antígeno viral.
• Considerar que la vacunación previa compromete la interpretación epidemiológica de la serología, porque con vacunas convencionales no es posible distinguir anticuerpos de origen vacunal de los de infección de campo, lo que obliga a apoyarse en detección de antígeno o material genético para el diagnóstico de portadores.
• Priorizar la detección de animales persistentemente infectados por sobre la discusión de qué vacuna emplear, siguiendo el orden de operaciones que caracterizó a los programas europeos exitosos, donde la vacuna llegó después del saneamiento y no en su reemplazo.
• Tener presente que la protección demostrada en este estudio es inmunogenicidad y no protección clínica ni fetal, dado que no se realizó desafío viral ni evaluación de descendencia.
• Verificar la correspondencia entre el subgenotipo de la vacuna empleada y el subgenotipo circulante en el predio o la zona cuando esa información esté disponible, dado el antecedente de que la protección contra descendencia persistentemente infectada falló cuando la cepa de campo difirió de la vacunal.
• Registrar y conservar el historial de vacunación del rebaño, porque sin ese dato la interpretación de cualquier muestreo serológico posterior queda comprometida.
• Considerar el muestreo predial pequeño en animales de seis a doce meses como herramienta de tamizaje de bajo costo para orientar la sospecha de infección activa, teniendo presente que no detecta animales persistentemente infectados muy jóvenes.